Aktualności - Monitorowanie poziomu tlenu rozpuszczonego w procesie fermentacji biofarmaceutycznej

Czym jest rozpuszczony tlen?

Tlen rozpuszczony (DO) odnosi się do tlenu cząsteczkowego (O_₂) rozpuszczony w wodzie. Różni się on od atomów tlenu obecnych w cząsteczkach wody (H_₂O), ponieważ występuje w wodzie w postaci niezależnych cząsteczek tlenu, pochodzących z atmosfery lub generowanych w procesie fotosyntezy przez rośliny wodne. Na stężenie DO wpływa wiele czynników, w tym temperatura, zasolenie, przepływ wody i aktywność biologiczna. W związku z tym stanowi on kluczowy wskaźnik oceny stanu zdrowia i zanieczyszczenia środowisk wodnych.

Tlen rozpuszczony odgrywa kluczową rolę w promowaniu metabolizmu drobnoustrojów, wpływając na oddychanie komórkowe, wzrost i biosyntezę produktów przemiany materii. Jednak wyższe poziomy tlenu rozpuszczonego nie zawsze są korzystne. Nadmiar tlenu może prowadzić do dalszego metabolizmu nagromadzonych produktów i potencjalnie powodować reakcje toksyczne. Optymalne poziomy tlenu rozpuszczonego różnią się w zależności od gatunku bakterii. Na przykład, podczas biosyntezy penicyliny, tlen rozpuszczony jest zazwyczaj utrzymywany na poziomie około 30% nasycenia powietrza. Jeśli tlen rozpuszczony spadnie do zera i pozostanie na tym poziomie przez pięć minut, tworzenie produktów może zostać znacznie upośledzone. Jeśli ten stan utrzymuje się przez 20 minut, mogą wystąpić nieodwracalne uszkodzenia.

Obecnie najczęściej stosowane czujniki DO mierzą jedynie względne nasycenie powietrza, a nie bezwzględne stężenie tlenu rozpuszczonego. Po sterylizacji pożywki hodowlanej przeprowadza się napowietrzanie i mieszanie, aż do ustabilizowania się odczytu czujnika. W tym momencie wartość ta jest ustawiana na 100% nasycenia powietrza. Kolejne pomiary w trakcie procesu fermentacji opierają się na tym punkcie odniesienia. Bezwzględnych wartości DO nie można określić za pomocą standardowych czujników i wymagają one bardziej zaawansowanych technik, takich jak polarografia. Jednak pomiary nasycenia powietrza są zazwyczaj wystarczające do monitorowania i kontrolowania procesów fermentacji.

W fermentorze poziomy DO mogą się różnić w zależności od regionu. Nawet po uzyskaniu stabilnego odczytu w jednym punkcie, w niektórych podłożach hodowlanych mogą nadal występować wahania. Większe fermentory wykazują zazwyczaj większe zróżnicowanie przestrzenne poziomów DO, co może znacząco wpływać na wzrost i produktywność mikroorganizmów. Dowody eksperymentalne wykazały, że chociaż średni poziom DO może wynosić 30%, wydajność fermentacji w zmiennych warunkach jest zauważalnie niższa niż w warunkach stabilnych. Dlatego też, w procesie zwiększania skali fermentorów – poza rozważaniami na temat podobieństwa geometrycznego i mocy – minimalizowanie przestrzennych zmian DO pozostaje kluczowym celem badań.

Dlaczego monitorowanie rozpuszczonego tlenu jest tak istotne w fermentacji biofarmaceutycznej?

1. Aby utrzymać optymalne środowisko wzrostu dla mikroorganizmów lub komórek
Fermentacja przemysłowa zazwyczaj obejmuje mikroorganizmy tlenowe, takie jak Escherichia coli i drożdże, lub komórki ssaków, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Komórki te pełnią funkcję „pracowników” w systemie fermentacji, wymagając tlenu do oddychania i aktywności metabolicznej. Tlen pełni funkcję terminalnego akceptora elektronów w oddychaniu tlenowym, umożliwiając produkcję energii w postaci ATP. Niedobór tlenu może prowadzić do uduszenia komórek, zahamowania wzrostu, a nawet śmierci komórek, co ostatecznie prowadzi do niepowodzenia fermentacji. Monitorowanie poziomu tlenu rozpuszczonego (DO) zapewnia, że stężenie tlenu utrzymuje się w optymalnym zakresie, co zapewnia długotrwały wzrost i żywotność komórek.

2. Aby zapewnić efektywną syntezę produktów docelowych
Celem fermentacji biofarmaceutycznej jest nie tylko promowanie proliferacji komórek, ale także ułatwienie wydajnej syntezy pożądanych produktów docelowych, takich jak insulina, przeciwciała monoklonalne, szczepionki i enzymy. Te szlaki biosyntezy często wymagają znacznego nakładu energii, pochodzącej głównie z oddychania tlenowego. Ponadto wiele układów enzymatycznych zaangażowanych w syntezę produktów jest bezpośrednio zależnych od tlenu. Niedobór tlenu może zaburzyć lub zmniejszyć wydajność tych szlaków.

Co więcej, poziom tlenu rozpuszczonego działa jako sygnał regulacyjny. Zarówno nadmiernie wysokie, jak i zbyt niskie stężenie tlenu rozpuszczonego może:
- Zmiana szlaków metabolicznych komórek, np. przejście z oddychania tlenowego na mniej wydajną fermentację beztlenową.
- Wywołują reakcje stresowe komórek, prowadzące do wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych.
- Wpływa na poziom ekspresji białek egzogennych.

Dzięki precyzyjnej kontroli poziomów DO na różnych etapach fermentacji możliwe jest ukierunkowanie metabolizmu komórkowego w kierunku maksymalnej syntezy produktu docelowego, a tym samym osiągnięcie fermentacji o dużej gęstości i wydajności.

Wprowadzenie do schematu przepływu wody dla produktów biofarmaceutycznych

3. Aby zapobiec niedoborowi lub nadmiarowi tlenu
Niedobór tlenu (hipoksja) może mieć poważne konsekwencje:
- Wzrost komórek i synteza produktów ustają.
- Metabolizm przesuwa się ku szlakom beztlenowym, co skutkuje gromadzeniem się kwasów organicznych, takich jak kwas mlekowy i kwas octowy, które obniżają pH środowiska hodowlanego i mogą zatruć komórki.
- Długotrwałe niedotlenienie może spowodować nieodwracalne uszkodzenia, a powrót do zdrowia nie będzie pełny nawet po przywróceniu dopływu tlenu.

Nadmiar tlenu (przesycenie) również niesie ze sobą ryzyko:
- Może wywoływać stres oksydacyjny i powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają błony komórkowe i biocząsteczki.
- Nadmierne napowietrzanie i mieszanie zwiększa zużycie energii i koszty operacyjne, co prowadzi do niepotrzebnego marnotrawstwa zasobów.

4. Jako krytyczny parametr monitorowania w czasie rzeczywistym i sterowania zwrotnego

DO to parametr mierzony w czasie rzeczywistym, ciągły i kompleksowy, odzwierciedlający wewnętrzne warunki systemu fermentacyjnego. Zmiany poziomu DO mogą precyzyjnie wskazywać różne stany fizjologiczne i operacyjne:
- Szybki wzrost komórek powoduje zwiększenie zużycia tlenu, co powoduje spadek poziomu tlenu rozpuszczonego.
- Wyczerpanie substratu lub jego zahamowanie spowalnia metabolizm, co powoduje zmniejszenie zużycia tlenu i wzrost poziomu rozpuszczonego tlenu.
- Zanieczyszczenie obcymi mikroorganizmami zmienia wzorzec zużycia tlenu, co prowadzi do nieprawidłowych wahań DO i stanowi wczesny sygnał ostrzegawczy.
- Nieprawidłowe działanie sprzętu, takie jak awaria mieszadła, zablokowanie przewodu wentylacyjnego lub zanieczyszczenie filtra, może również powodować nieprawidłowe zachowanie się DO.

Dzięki zintegrowaniu monitorowania DO w czasie rzeczywistym z automatycznym systemem sterowania ze sprzężeniem zwrotnym możliwe jest precyzyjne regulowanie poziomów DO poprzez dynamiczną regulację następujących parametrów:
- Prędkość mieszania: Zwiększenie prędkości poprawia kontakt gaz-ciecz poprzez rozbijanie pęcherzyków, co poprawia efektywność transferu tlenu. Jest to najczęściej stosowana i najskuteczniejsza metoda.
- Szybkość napowietrzania: Regulacja szybkości przepływu lub składu gazu wlotowego (np. zwiększenie udziału powietrza lub czystego tlenu).
- Ciśnienie w zbiorniku: Wzrost ciśnienia powoduje wzrost ciśnienia parcjalnego tlenu, co zwiększa rozpuszczalność.
- Temperatura: Obniżenie temperatury zwiększa rozpuszczalność tlenu w podłożu hodowlanym.

Zalecenia produktowe BOQU do monitorowania fermentacji biologicznej online: